植物源農(nóng)藥研究進(jìn)展

    在中國，由于化學(xué)農(nóng)藥的濫用導(dǎo)致40種以上的主要農(nóng)作物的病原微生物和害蟲產(chǎn)生抗藥性、生態(tài)環(huán)境惡化、生物多樣性水平降低等一系列問題，而且傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥往往含有對人畜有害的成分，以植物體內(nèi)對病原菌具有拮抗性的化學(xué)物質(zhì)為主要成分的植物源農(nóng)藥，因其具有低毒、低殘留、對非靶標(biāo)生物及環(huán)境安全的特點(diǎn)而越來越受到重視。據(jù)研究，常用植物源農(nóng)藥有生物堿類化合物、黃酮類化合物、萜類化合物、揮發(fā)油等，不同類型的化合物具有不同的骨架結(jié)構(gòu)，根據(jù)化合物特性的的不同，選擇不同方式進(jìn)行提取，不同的化合物也具有不同的抑菌及提高植物抗氧化力等生理特性。本文綜述了植物源農(nóng)藥中常見活性成分的結(jié)構(gòu)表征、提取方式及其抑菌研究進(jìn)展，旨為植物源農(nóng)藥的開發(fā)提供技術(shù)支撐。
一、植物源農(nóng)藥常用的活性提取物

1.生物堿類化合物
 
    目前已發(fā)現(xiàn)的21,000多種生物堿類化合物，多分布在茄科植物的種、果、花、莖等植物部位。生物堿類化合物大多為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，氮素被包含在碳環(huán)內(nèi)。在抑菌時C1、C2、C9和C10中的羥基作為取代基會出現(xiàn)結(jié)構(gòu)取代的情況。生物堿常見類型有異喹啉類生物堿、喹啉類生物堿、吲哚類生物堿、哌啶類生物堿等，其中N-甲基四氫原小檗堿、原小檗堿和苯胺類生物堿的C2和C3的4階碳和亞甲二氧基在提高N-甲基四氫原小檗堿的抗病毒、抗菌和抗真菌活性方面起著重要作用。當(dāng)進(jìn)行生物堿類化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化時，可重點(diǎn)優(yōu)化生物堿的C2和C3的4階碳和亞甲二氧基，從而提高該類型化合物的抑菌效果。
 
2.黃酮類化合物
 
    黃酮類化合物目前已發(fā)現(xiàn)800余種，屬于植物的次生代謝物質(zhì)。黃酮類的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型較多，一般以C6-C3-C6的形式為基礎(chǔ)。黃酮類化合物是苯并-γ-pyrone衍生物，當(dāng)病菌對其進(jìn)行侵染時，它會根據(jù)其側(cè)組位置和換位進(jìn)行分類；其藥理作用主要是根據(jù)它的結(jié)構(gòu)類別、羥基化程度、其他取代和共軛以及聚合程度相互協(xié)同合作，其中類黃酮在生物系統(tǒng)中保護(hù)作用歸因于它們傳遞氫或電子自由基的能力；而芳香環(huán)上特殊位置的羥基能夠提高抑菌作用。在進(jìn)行黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化時，可先尋找到該物質(zhì)芳香環(huán)的羥基，調(diào)整其位置，再查看該羥基在新位置上與它的結(jié)構(gòu)類別、其他取代和共軛以及聚合程度互相協(xié)作的效果，從而達(dá)到整體提高黃酮類化合物的抑菌效果。

3.萜類化合物
 
    在天然產(chǎn)物中，萜類化合物是結(jié)構(gòu) 多、結(jié)構(gòu) 大的化合物之一，目前已發(fā)現(xiàn)50,000多種。萜類化合物可根據(jù)異戊二烯進(jìn)行分類，即將不同碳數(shù)量及組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行線性排列，形成多個異戊二烯單元組成的頭尾相連的異戊二烯聚合體，少部分萜類化合物也會以各種含氧衍生物的形式存在。萜類化合物主要由甲羥戊酸途徑生成，但也可能來源于2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸，而缺少吡喃環(huán)時，則一般被認(rèn)為沒有活性，不具備抑菌作用。在進(jìn)行萜類化合物的結(jié)構(gòu)優(yōu)化時，可以吡喃環(huán)為切入點(diǎn)進(jìn)行研究，來提高萜類化合物的抑菌效果。

4.揮發(fā)油
   
    揮發(fā)油又稱植物精油，主要來自芳香植物，是脂溶性的天然化合物。植物精油成分復(fù)雜，按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為芳香族、脂肪族和萜類，其中以萜類成分為主，主要包括單帖、倍半萜以及醇類、酚類、醚類、醛、酮、羧酸和酯等含氧衍生物。揮發(fā)油的活性可能是由某些小化合物如香芹酮的存在所致。揮發(fā)油所含成分太多，可推測出抑菌作用主要源于它的組成成分的協(xié)同作用，并非一種物質(zhì)的作用。進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化太過復(fù)雜。
 
二、活性物質(zhì)提取方式
 
    植物會通過自身的代謝功能合成不同的化學(xué)物質(zhì)以及衍生物，這些物質(zhì)具有抑菌、抗病、抗氧化等作用。因此可以根據(jù)不同成分的特性選擇合適提取方式進(jìn)行成分提取。
 
1.生物堿類化合物
 
    在提取生物堿時，生物堿的溶解性能是提取方式選擇依據(jù)，因此根據(jù)不同生物堿在不同溶劑中的溶解度進(jìn)行溶劑選擇，在進(jìn)行親水性生物堿的提取時要注意溶劑酸堿度的調(diào)節(jié)。Wei等將白屈菜粉碎后超聲波提取，固液比為1∶8，提取液為75%乙醇，85%超聲頻率提取35 min得到白屈菜紅堿；白屈菜紅堿濃度為1.7×10^-6mg/mL時，抑菌活性 高，對番茄枯萎病菌Z0413、黃瓜枯萎病菌Z0418等具有使用量少、抑菌性強(qiáng)的特點(diǎn)。Han等將延胡索粉碎后用正乙烷、乙酸乙酯、氯仿浸提分餾，純化后得到3種異喹啉生物堿脫氫木犀草堿、針刺堿和蟲草堿，3種堿對小麥葉銹病菌、花椒炭疽病菌均有一定的抑制作用，研究發(fā)現(xiàn)C-13和季銨鹽中甲基的缺失氮原子在抗真菌藥物中起著重要作用。陳偉等依次使用乙酸、氨水、正丁醇和甲醇對馬鈴薯薯芽與薯皮進(jìn)行粉碎萃取，不斷調(diào)節(jié)溶劑酸堿度， 后得到馬鈴薯糖苷生物堿；隨著濃度增大，馬鈴薯糖苷生物堿對枸杞致腐病原菌鐮孢菌的抑制作用隨之增強(qiáng)，但濃度不能高于0.15 g/mL。周兵等按照醇-酸水-有機(jī)溶劑提?。?5%乙醇回流提取2 h后，依次用酸性水溶液和濃氨水進(jìn)行酸堿處理， 后用氯仿萃取）法對碎米莎草莖進(jìn)行總生物堿提?。浑S著濃度的增加，總生物堿對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、番茄早疫病菌和楊樹潰瘍病菌的抑制作用隨之增加，但對水稻苗高有嚴(yán)重抑制作用。
因此，在提取生物堿時，不光要根據(jù)溶劑極性來提取對應(yīng)的生物堿類化合物，還要在提取過程中不斷調(diào)節(jié)溶劑的酸堿度。不同類型的生物堿對不同的植物病害有一定的抑制作用，總生物堿類化合物不能用于水稻田，會影響水稻幼苗的生長。

2.黃酮類化合物
 
    黃酮類化合物提取的關(guān)鍵在于所提取的黃酮類物質(zhì)是游離苷元還是苷類化合物，不同的化合物使用極性不同的溶劑，極性越大的溶劑所提取的極性化合物含量會越多，不同極性的溶劑混合提取會出現(xiàn)協(xié)同作用。Bartmańska等使用不同極性的溶劑分別從廢除的啤酒花殘渣中浸提得到7種黃酮類化合物，其中2種為天然黃酮（α,β-二羥基胡蘿卜素和8-丙基柚皮素），提取黃腐醇含量 多的溶劑是甲醇＋二氯甲烷；丙酮、乙酸乙酯、甲醇的粗提物對鐮刀菌的抑制所差無幾，而亞甲基氯化物則對灰霉病菌有較強(qiáng)的抑制作用。EL-Hefny等使用乙酸乙酯和甲醇分別對大黃的根部進(jìn)行萃取，分餾分離后物質(zhì)用蒸餾水配制成含有黃酮-3-醇和二苯乙烯的藥液，并對田間感染稻瘟菌的小麥進(jìn)行抑菌試驗；結(jié)果顯示，其能顯著抑制病菌孢子的萌發(fā)。

3.萜類化合物
 
    萜類化合物常用的提取方式為壓榨法、水蒸氣蒸餾法、脂浸潤法、超靈界流體萃取法和溶劑提取法。前4種方法可用于提取精油，一般萜類提取都是根據(jù)提取物質(zhì)的苷元形式選擇不同極性、不同沸點(diǎn)的溶劑。Oludemi等將靈芝 行乙醇回流提取，干燥后按照提取時間78.9 min、提取溫度90℃、溶劑62.5%乙醇進(jìn)行熱萃取，得到提取率為（4.9±0.6）%，含量為（435.6±21.1）mg/g的三萜。Popov等研究發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯提取白樺醇的純度比95%乙醇提取的白樺醇純度高，并且可以在乙酸乙酯提取完白樺醇之后，使用水蒸餾法將提取殘渣中的乙酸乙酯回收，形成綠色萃取。Qun等通過使用蒸餾水，保證1∶55 （g/mL）的固液比，在超聲波-微波輻照功率90Ｗ，提取周期75 s的條件下對角果進(jìn)行三萜類化合物提取，得到16.789 mg/g，與預(yù)期相符。

4.揮發(fā)油
 
    揮發(fā)油 常見的成分就是單帖及倍半萜，因此提取精油時常用水蒸氣法和超臨界流體萃取法。Bammou等通過水精蒸餾裝置對蚤草屬進(jìn)行水蒸氣蒸餾，提取精油對尖孢鐮刀菌有一定的抗性。Shukla等使用超臨界CO₂對干姜進(jìn)行多分離器在線分餾，CO₂回收率為96.15%。工業(yè)生產(chǎn)中的工藝優(yōu)化及其驗證標(biāo)度單位表明，超臨界CO₂萃取和同步萃取分餾可用于一系列天然生物活性化合物，如維生素、必需脂肪酸。Agha等采用二維氣相色譜法和簡易氣相色譜法對天竺葵提取揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行檢測，揮發(fā)油的主要成分是香茅醇、香葉醇和芳樟醇。揮發(fā)油也多用于果蔬保鮮及美妝行業(yè)中，所以使用超臨界CO₂作為萃取劑，既價格低廉，又無殘留，且不破壞化合物結(jié)構(gòu)。在提取各類化合物時，除了根據(jù)不同提取物質(zhì)選擇不同極性的溶劑外，可以采用微波輔助提取或超聲波輔助提取方式。對比傳統(tǒng)的溶劑提取法，通過超聲或微波產(chǎn)生切向力，使溶劑滲入，加速有效成分進(jìn)入提取溶劑中，從而提高提取率，且不降低提取物的活性。郭孝武分別使用超聲波輔助提取法、回流提取法、浸提法對益母草的總生物堿進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)超聲波輔助提取法的提取率較其他2種方法要高，且未改變提取物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。
 
三、活性物質(zhì)抑菌機(jī)制

1.生物堿類化合物
 
    生物堿類化合物可以在需要保護(hù)的細(xì)胞上形成一層保護(hù)膜，從而減少其他病菌對細(xì)胞的破壞。Zhao等使用異喹啉生物堿對稻瘟病菌進(jìn)行抑制試驗，結(jié)果表明，菌絲體彎曲、崩解，細(xì)胞膜完整性受損，同時還抑制菌絲的活性氧生成，破壞了菌絲的膜功能和細(xì)胞增殖。
對于病菌抑制，生物堿類化合物可對病菌細(xì)胞基因及酶類進(jìn)行影響，或者對細(xì)胞膜、菌絲生長形態(tài)造成影響，從而達(dá)到抗病的作用。

2.黃酮類化合物
 
    黃酮類化合物的抗病性可能是非特異性的，通過黃酮類化合物的抗氧化性，使致病菌因缺氧而失去活性，影響生物膜的形成、膜的通透性等生理特性，影響某些酶對細(xì)胞質(zhì)的抑制。Rachmawaty等對干燥的可可果進(jìn)行粉碎后使用7∶3的丙酮水溶液浸提3次，得到黃酮類化合物，發(fā)現(xiàn)其對尖孢菌的孢子有強(qiáng)烈的抑制作用。Chen等研究發(fā)現(xiàn)黃芩素在32和64μg/mL時對病菌具有下調(diào)群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)因子及基因細(xì)胞間粘附素在生物膜中的表達(dá)生產(chǎn)細(xì)胞的能力。
 
3.萜類化合物
 
    萜類化合物對真菌的抑制作用主要表現(xiàn)在對真菌菌絲的生長抑制，使其尖端膨脹、分支形成孢子?；蚴咕z斷裂，對細(xì)胞造成破壞以及對真菌細(xì)胞蛋白的下調(diào)。楊婷等對13種萜類化合物進(jìn)行抑菌篩選，其中，香芹酚、丁香酚、異丁香酚、枯茗醛、百里香酚對孢炭疽菌的 佳抑制濃度為50μg/mL。Alexa等對丹參和百里香分別進(jìn)行萃取，得到γ-松油烯和ｐ-百里香酚，兩者混合對禾谷鐮刀菌有一定的抑制協(xié)同作用。丁蘭等從香茶菜屬中分離出4種萜類物質(zhì)（leukamein E、weisiensin B、熊果酸和2-α-羥基熊果酸），并考察幾種物質(zhì)對蝴蝶蘭莖腐病中分離出的鐮孢屬真菌的抑制活性；發(fā)現(xiàn)真菌的菌絲簡短膨大成為囊泡，出現(xiàn)斷裂，逐漸變?yōu)榭张?；菌絲體細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，且大大改變了其通透性。


4.揮發(fā)油
 
    揮發(fā)油是通過精油及其組分對細(xì)胞膜造成破壞，增大膜的通透性，致使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏，或直接破壞病菌的酶系統(tǒng)，致其死亡。Moghaddam等發(fā)現(xiàn)從山羊草種子中提取的精油對青枯病菌有較強(qiáng)的抑制活性，能夠顯著抑制菌絲的生長。Yu等考察從茶樹中提取的精油對灰霉病菌的抑制活性，研究發(fā)現(xiàn)精油中的α-松油醇、1,8-桉葉素混合后能穿透病菌細(xì)胞，破壞細(xì)胞器而不影響細(xì)胞膜透性。相比之下，松油烯破壞了膜的完整性，增加了膜的通透性，導(dǎo)致離子滲漏和膜功能障礙。
 
四、展望
 
    目前研究人員對各類植物源化合物已有一定的研究，但不同類型化合物的生物功能和生態(tài)化學(xué)功能尚未被充分研究，例如化合物在植物體內(nèi)代謝過程、所具有的功能，以及在生態(tài)環(huán)境中的存在形式與歸宿途徑等。
 
    在提取工藝中，不僅要考慮優(yōu)化工藝增加物質(zhì)提取率或提取出其他物質(zhì)類型，還要考慮提取成本，以及商業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，是否適用于工廠批量化生產(chǎn)。例如將許多高質(zhì)量的有價值的化合物被一個單一的步驟回收，從某種低廉的植物中得到大量高質(zhì)量的化合物等。對于植物源農(nóng)藥，所需化合物的活性篩選仍然是新農(nóng)藥開發(fā)的關(guān)鍵步驟，具有較高活性的化合物可以直接開發(fā)為新藥。化合物的結(jié)構(gòu)對于抑菌活性有著重要影響，因此可以將“組學(xué)”技術(shù)與分子網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相結(jié)合，在原物質(zhì)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，合成具有高效抑菌能力的新物質(zhì)。
 
來源：《黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)》2021年第7期
作者：淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院  于忻瀅  張國良  范松  黃志煒  張葉